Brooklynli tesisatçı kardeşler Mario ve Luigi, sıradan bir su borusu tamiri sırasında gizemli bir boruya girerek kendilerini Mantar Krallığı adında büyülü bir dünyada bulur. Ancak bu beklenmedik yolculuk onları ayırır ve Mario, kardeşini kaybeder. Mario, Luigi’yi bulmak için bu renkli ama tehlikeli krallıkta bir maceraya atılır.

Mario’nun yolculuğu sırasında Mantar Krallığı’nın neşeli sakini Toad ona eşlik eder. Prenses Peach ise Mario’ya savaş becerileri kazandırarak onu krallığı tehdit eden güçlere karşı hazırlar. Mario, bu süreçte içindeki cesareti ve daha önce fark etmediği gücü keşfeder. Kardeşini kurtarma hedefi, onu kişisel bir dönüşüme sürükler.

Mario ve Luigi’nin tekrar bir araya gelme mücadelesi, onları Mantar Krallığı’nın kaderini belirleyecek epik bir çatışmanın içine çeker. İki kardeş, karşılaştıkları engelleri aşarak hem birbirlerine hem de bu fantastik dünyanın geleceğine sahip çıkmak için savaşır.